一步法sgRNA体外转录试剂盒

产品货号：

JN3032

中文名称：

一步法sgRNA体外转录试剂盒

英文名称：

One-step sgRNA In VitroTranscription Kit

产品规格：

10T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒用于为CRISPR/Cas9基因编辑系统高效转录sgRNA。可以在30分钟内一步法高效合成sgRNA，产量可达10～30μg。再通过sgRNA体外筛选试剂盒（JN3033）筛选出效率高的sgRNA，用于Crispr基因编辑实验。

背景资料

CRISPR/Cas9是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA指导Cas9蛋白对靶向基因进行编辑的技术。CRISPR/Cas9的切割是通过向导RNA(gRNA)与打靶基因组位置之间约20bp碱基的配对，且打靶序列的3'端需要有PAM结构(NGG)，再引导Cas9作用实现的。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处10～12bp碱基的配对，而其余远离PAM处8～10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不明显，这导致了CRISPR/Cas9存在一定的脱靶性，可能发生非特异性切割，引起基因组非靶向位点的突变，这样会造成研究结果的不确定性以及研究工作量的大量增加。

应用实例


图1．使用本试剂盒转录sgRNA，大小为97nt。	图2．将转录出的sgRNA做体外切割检测。泳道2、3：sgRNA切割后条带1500bp、1000bp、500bp

组分	规格
2×sgRNA Reaction Buffer	150μL
Enzyme Mix	20μL
DNase I（2U/μL）	10μL
RNase-Free Water	1mL

保存：-20℃

sgRNA模板扩增
扩增引物设计：
选取Target DNA序列PAM（NGG）的5'端20bp进行正向（F）引物设计，引物结构包含T7 promoter（20bp）、Target DNA片段（20bp）和实际与反向引物结合的片段（21bp）。引物设计如下：

如Target DNA片段为5’-TCCCCGCTGCAGCATAGTGAGCCCAGAANGGCATT-3’，则引物设计如下：
sgRNA体外转录体系
- 依次加入以下反应成分配制转录体系：
  成分用量
  2×sgRNA Reaction Buffer 10μL
  正向引物（10μM） 2μL
  Enzyme Mix 2μL
  RNase-Free Water 至20μL
- 37℃反应0.5-2h。
  注：转录时间0.5-2h即可，如需得到更多sgRNA，可适当延长至3h。
sgRNA纯化
- 模板DNA的去除：
  向转录产物中加1μL DNase Ⅰ，37℃反应10min，以去除DNA模板，将反应产物放入75℃反应10min，得到的sgRNA置于-20℃保存。sgRNA可直接用于切割，如需纯化，可选择以下sgRNA纯化步骤，但sgRNA会有所损失。
- sgRNA纯化(可选)：
  - 转录体系20μL用RNase Free Water补至300μL，加入等体积酚?氯仿?异戊醇（25:24:1），充分混合后，12000rpm，4℃离心15min。
  - 取上清，加入300μL氯仿，充分混匀后，12000rpm，4℃离心5min。
  - 取上清约200μL，为提高回收量，下层可再加入100μL RNase Free Water，充分混合后，4℃离心5min，取上清。
  - 将两次取的上清合并，总体积约300～350μL，加入2倍体积的异丙醇和1/10体积的用RNase-Free Water配置的3M NaAc，-80℃沉淀过夜。
  - 离心取沉淀，加入1mL RNase Free Water配制的75%乙醇，洗涤两次。
  - 用20μL RNase Free Water溶解RNA，电泳检测质量并进行浓度测定。

货号	名称	说明
JN0065	NLS-Cas9 Nuclease
JN3003	Cas9 D10A Nickase	能在与sgRNA靶序列互补的DNA链上产生切口，从而形成功能性的单链断裂，可以减少意外的脱靶基因修饰。
JN3004	Cas9 H840A Nickase	能在与sgRNA靶序列非互补的DNA链上产生切口，从而形成功能性的单链断裂，可以减少意外的脱靶基因修饰。
JN3005	Cas9(D10A,H840A)Nuclease	为Cas9 D10A和H840A双突变失活酶，具有靶DNA结合活性，但无切割活性，可用于阴性对照等用途。

成分	用量
2×sgRNA Reaction Buffer	10μL
正向引物（10μM）	2μL
Enzyme Mix	2μL
RNase-Free Water	至20μL

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